This thesis, codirected by Vicente Arnau and Carmen Ivorra, is the result of the collaboration of I2SysBio with the company Sequencing Multiplex SL and proposes three optimised primer design strategies for PCR with the aim of satisfying the needs of different applications of this amplification technology. Part of the research results have been published in the journal BMC Genomics. The thesis was defended on 7 March 2025.

Despite the increase in new PCR-based technologies and applications, primer design remains a challenge and a bottleneck for many configurations, requiring several rounds of optimisation. Primers determine the specificity and efficiency of the amplification, as well as the reproducibility. All primers must be specific for their target and not amplify spurious sequences, such as primer dimers or regions outside the region of interest (ROI). In the present doctoral thesis, entitled &lsquo;Bioinformatic Pipelines to the Rescue of Primer Design: Development of DrPrimer, EOSAL-Primer and ExonSurfer for Specific PCR Applications&rsquo;, three different primer design processes are presented, aimed at three PCR applications with specific requirements.

Firstly, a primer design process is proposed for the creation of amplicon-based libraries for specific gene panels: DrPrimer. A key step in targeted sequencing is the enrichment of the ROI, which is usually carried out by multiplex PCR, creating an amplicon-based library. In cases where large regions are being searched, it is necessary to design mosaic amplicons. This, together with the additional requirements of multiplex PCR, makes manual design a problematic process. Primers that produce overlapping amplicons must be placed in separate reaction groups and, since fewer groups are preferable to reduce costs and pipetting, it is necessary to verify all primers in the same group for amplification of dimers or off-target products. DrPrimer designs multiple candidate primers, which are filtered according to their tendency to create dimers and their specificity. DrPrimer incorporates an innovative coverage prediction model that takes into account all the primers and their designated groups, and reports which of them will produce amplicons with below-average coverage. As a final evaluation of the method, 10 genes from a diabetes-related panel were chosen and the naive primers were compared with the panel designed with DrPrimer, demonstrating that the primers suggested by DrPrimer produce a higher percentage of target reads.

Secondly, EOSAL-Primers was developed, an application focused on the design of primers necessary for the EOSAL-CNV technique. EOSAL-CNV panels must be designed so that each amplicon has a unique length. To solve this problem, multiple candidate primers of different sizes were created for each ROI and a branching and linking algorithm was used that greatly reduces the list of candidates to only compatible combinations.

Finally, ExonSurfer is presented, a comprehensive web tool for designing primers for RT-qPCR with intercalating dyes. This primer design process focuses on gene expression experiments in which genomic DNA amplification is a contaminant. Primers are designed to span exon-exon junctions and are filtered for specificity and tendency to form dimers. The process is integrated into an easy-to-use web application, with amplicon visualisation tools. ExonSurfer has been tested in a real case, demonstrating high precision and specificity, which makes it a key tool in the analysis of gene expression.

Cristina Rusu carried out her doctoral research as a result of the collaboration between the Theory, Bioinformatics and Computing group of I2SysBio, co-directed by Vicente Arnau, professor at the University of Valencia, and the company Sequencing Multiplex SL (UV Science Park), co-directed by Carmen Ivorra, scientific director of the company. During the development of the thesis, Cristina Rusu benefited from a contract from the Industrial Doctorate programme of the State Research Agency (AEI). She also carried out a research stay in Johanna Gostner&#39;s laboratory at the Institute of Medical Biochemistry, Medical University of Innsbruck. The examining board was composed by Maria Vinaixa (Universitat Rovira i Virgili), Martie Verschuren (Avans University of Applied Sciences) and M&aacute;ria Džunkov&aacute; (I2SysBio), who rated the thesis as outstanding.

Esta tesis, codirigida por Vicente Arnau y Carmen Ivorra, es fruto de la colaboraci&oacute;n del I2SysBio con la empresa Sequencing Multiplex SL y en ella se proponen tres estrategias optimizadas de dise&ntilde;o de cebadores para PCR con el objetivo de satisfacer las necesidades de diferentes aplicaciones de esta tecnolog&iacute;a de amplificaci&oacute;n. Parte de los resultados de la investigaci&oacute;n se han publicado en la revista BMC Genomics. La tesis se defendi&oacute; el 7 de marzo de 2025.

A pesar del aumento de nuevas tecnolog&iacute;as y aplicaciones basadas en PCR, el dise&ntilde;o de cebadores sigue siendo un reto y un cuello de botella para muchas configuraciones, requiriendo varias rondas de optimizaci&oacute;n. Los cebadores determinan la especificidad y la eficiencia de la amplificaci&oacute;n, as&iacute; como la reproducibilidad. Todos los cebadores deben ser espec&iacute;ficos para su objetivo y no amplificar secuencias espurias, como d&iacute;meros de cebadores o regiones fuera de la regi&oacute;n de inter&eacute;s (ROI). En la presente tesis doctoral, titulada &ldquo;Bioinformatic Pipelines to the Rescue of Primer Design: Development of DrPrimer, EOSAL-Primer and ExonSurfer for Specific PCR Applications&rdquo;, se presentan tres procesos diferentes de dise&ntilde;o de cebadores, dirigidos a tres aplicaciones de PCR con requisitos espec&iacute;ficos.

En primer lugar, se propone un proceso de dise&ntilde;o de cebadores destinado a la creaci&oacute;n de bibliotecas basadas en amplicones para paneles de genes espec&iacute;ficos: DrPrimer. Un paso clave de la secuenciaci&oacute;n dirigida es el enriquecimiento de las ROI, que suele llevarse a cabo mediante una PCR multiplex, creando una biblioteca basada en amplicones. En los casos en que se buscan regiones amplias, es necesario dise&ntilde;ar amplicones en mosaico. Esto, junto con los requisitos adicionales de una PCR multiplex, hace que el dise&ntilde;o manual sea un proceso problem&aacute;tico. Los cebadores que producen amplicones superpuestos deben colocarse en grupos de reacci&oacute;n separados y, dado que es preferible la menor cantidad de grupos para reducir los costes y el pipeteo, es necesario verificar todos los cebadores de un mismo grupo para la amplificaci&oacute;n de d&iacute;meros o productos fuera de objetivo. DrPrimer dise&ntilde;a m&uacute;ltiples cebadores candidatos, que se filtran en funci&oacute;n de su tendencia a crear d&iacute;meros y su especificidad. DrPrimer incorpora un novedoso modelo de predicci&oacute;n de cobertura que tiene en cuenta todos los cebadores y sus grupos designados, e informa cu&aacute;les de ellos producir&aacute;n amplicones con una cobertura inferior a la media. Como evaluaci&oacute;n final del m&eacute;todo, se eligieron 10 genes de un panel relacionado con la diabetes y se compararon los cebadores naifs con el panel dise&ntilde;ado con DrPrimer, demostr&aacute;ndose que los cebadores sugeridos por DrPrimer producen un mayor porcentaje de lecturas diana.

En segundo lugar, se desarroll&oacute; EOSAL-Primers, una aplicaci&oacute;n centrada en el dise&ntilde;o de cebadores necesarios para la t&eacute;cnica EOSAL-CNV. Los paneles EOSAL-CNV deben dise&ntilde;arse de manera que cada amplic&oacute;n tenga una longitud &uacute;nica. Para resolver este problema, se crearon m&uacute;ltiples cebadores candidatos de diferentes tama&ntilde;os para cada ROI y se utiliz&oacute; un algoritmo de ramificaci&oacute;n y enlace que reduce en gran medida la lista de candidatos a solo combinaciones compatibles.

Por &uacute;ltimo, se presenta ExonSurfer, una herramienta web integral destinada al dise&ntilde;o de cebadores para RT-qPCR con colorantes intercalantes. Este proceso de dise&ntilde;o de cebadores se centra en experimentos de expresi&oacute;n g&eacute;nica en los que la amplificaci&oacute;n de DNA gen&oacute;mico es un contaminante. Los cebadores se dise&ntilde;an para abarcar uniones ex&oacute;n-ex&oacute;n y se filtran seg&uacute;n su especificidad y tendencia a formar d&iacute;meros. El proceso est&aacute; integrado en una aplicaci&oacute;n web f&aacute;cil de usar, con herramientas de visualizaci&oacute;n de amplicones. ExonSurfer se ha probado en un caso real, demostrando una alta precisi&oacute;n y especificidad, lo que lo convierte en una herramienta clave en el an&aacute;lisis de la expresi&oacute;n g&eacute;nica.

Cristina Rusu realiz&oacute; su investigaci&oacute;n doctoral como resultado de la colaboraci&oacute;n entre el grupo de Teor&iacute;a, Bioinform&aacute;tica y Computaci&oacute;n del I2SysBio, con la codirecci&oacute;n de Vicente Arnau, profesor de la Universitat de Val&egrave;ncia, y la empresa Sequencing Multiplex SL (Parc Cient&iacute;fic de la UV), con la codirecci&oacute;n de Carmen Ivorra, directora cient&iacute;fica de la empresa. Durante el desarrollo de la tesis, Cristina Rusu disfrut&ccedil;&oacute; de un contrato del programa de Doctorado Industrial de la Agencia Estatal de Investigaci&oacute;n (AEI). Asimismo, realiz&oacute; una estancia de investigaci&oacute;n en el laboratorio de Johanna Gostner en el Institute of Medical Biochemistry, Medical University of Innsbruck. El tribunal calificador estuvo formado por Maria Vinaixa (Universitat Rovira i Virgili), Martie Verschuren (Avans University of Applied Sciences) y M&aacute;ria Džunkov&aacute; (I2SysBio), que calific&oacute; la tesis como sobresaliente.

Aquesta tesi, codirigida per Vicente Arnau i Carmen Ivorra, &eacute;s fruit de la col&middot;laboraci&oacute; de l&#39;I2SysBio amb l&#39;empresa Sequencing Multiplex SL i en ella es proposen tres estrat&egrave;gies optimitzades de disseny d&#39;encebadors per a PCR amb l&#39;objectiu de satisfer les necessitats de diferents aplicacions d&#39;aquesta tecnologia d&#39;amplificaci&oacute;. Part dels resultats de la investigaci&oacute; s&#39;han publicat en la revista BMC Genomics. La tesi es va defensar el 7 de mar&ccedil; de 2025.

Malgrat l&#39;augment de noves tecnologies i aplicacions basades en PCR, el disseny d&#39;encebadors continua sent un repte i un coll de botella per a moltes configuracions, requerint diverses rondes d&#39;optimitzaci&oacute;. Els encebadors determinen l&#39;especificitat i l&#39;efici&egrave;ncia de l&#39;amplificaci&oacute;, aix&iacute; com la reproductibilitat. Tots els encebadors han de ser espec&iacute;fics per al seu objectiu i no amplificar seq&uuml;&egrave;ncies esp&uacute;ries, com a d&iacute;mers d&#39;encebadors o regions fora de la regi&oacute; d&rsquo;inter&egrave;s (ROI). En la present tesi doctoral, titulada &ldquo;Bioinformatic Pipelines to the Rescue of Primer Design: Development of DrPrimer, EOSAL-Primer and ExonSurfer for Specific PCR Applications&rdquo;, es presenten tres processos diferents de disseny d&#39;encebadors, dirigits a tres aplicacions de PCR amb requisits espec&iacute;fics.

En primer lloc, es proposa un proc&eacute;s de disseny d&#39;encebadors destinat a la creaci&oacute; de biblioteques basades en amplicons per a panells de gens espec&iacute;fics: DrPrimer. Un pas clau de la seq&uuml;enciaci&oacute; dirigida &eacute;s l&#39;enriquiment de les ROI, que sol dur-se a terme mitjan&ccedil;ant una PCR multiplex, creant una biblioteca basada en amplicons. En els casos en qu&egrave; es busquen regions &agrave;mplies, &eacute;s necessari dissenyar amplicons en mosaic. Aix&ograve;, juntament amb els requisits addicionals d&#39;una PCR multiplex, fa que el disseny manual siga un proc&eacute;s problem&agrave;tic. Els encebadors que produeixen amplicons superposats han de col&middot;locar-se en grups de reacci&oacute; separats i, at&egrave;s que &eacute;s preferible la menor quantitat de grups per a reduir els costos i el pipetejat, &eacute;s necessari verificar tots els encebadors d&#39;un mateix grup per a l&#39;amplificaci&oacute; de d&iacute;mers o productes fora d&#39;objectiu. DrPrimer dissenya m&uacute;ltiples encebadors candidats, que es filtren en funci&oacute; de la seua tend&egrave;ncia a crear d&iacute;mers i la seua especificitat. DrPrimer incorpora un nou model de predicci&oacute; de cobertura que t&eacute; en compte tots els encebadors i els seus grups designats, i informa quins d&#39;ells produiran amplicons amb una cobertura inferior a la mitjana. Com a avaluaci&oacute; final del m&egrave;tode, es van triar 10 gens d&#39;un panell relacionat amb la diabetis i es van comparar els encebadors na&iuml;fs amb el panell dissenyat amb DrPrimer, demostrant-se que els encebadors suggerits per DrPrimer produeixen un major percentatge de lectures diana.

En segon lloc, es va desenvolupar EOSAL-Primers, una aplicaci&oacute; centrada en el disseny d&#39;encebadors necessaris per a la t&egrave;cnica EOSAL-CNV. Els panells EOSAL-CNV han de dissenyar-se de manera que cada amplic&oacute; tinga una longitud &uacute;nica. Per a resoldre aquest problema, es van crear m&uacute;ltiples encebadors candidats de diferents grand&agrave;ries per a cada ROI i es va utilitzar un algorisme de ramificaci&oacute; i enlla&ccedil; que redueix en gran manera la llista de candidats a nom&eacute;s combinacions compatibles.

Finalment, es presenta ExonSurfer, una eina web integral destinada al disseny d&#39;encebadors per a RT-qPCR amb colorants intercalats. Aquest proc&eacute;s de disseny d&#39;encebadors se centra en experiments d&#39;expressi&oacute; g&egrave;nica en els quals l&#39;amplificaci&oacute; de DNA gen&ograve;mic &eacute;s un contaminant. Els encebadors es dissenyen per a abastar unions ex&oacute;-ex&oacute; i es filtren segons la seua especificitat i tend&egrave;ncia a formar d&iacute;mers. El proc&eacute;s est&agrave; integrat en una aplicaci&oacute; web f&agrave;cil d&#39;usar, amb eines de visualitzaci&oacute; d&#39;amplicons. ExonSurfer s&#39;ha provat en un cas real, demostrant una alta precisi&oacute; i especificitat, la qual cosa el converteix en una eina clau en l&#39;an&agrave;lisi de l&#39;expressi&oacute; g&egrave;nica.

Cristina Rusu realitz&agrave; la seua investigaci&oacute; doctoral com a resultat de la col&middot;laboraci&oacute; entre el grup de Teoria, Bioinform&agrave;tica i Computaci&oacute; de l&#39;I2SysBio, amb la codirecci&oacute; de Vicente Arnau, professor de la Universitat de Val&egrave;ncia, i l&#39;empresa Sequencing Multiplex SL (Parc Cient&iacute;fic de la UV), amb la codirecci&oacute; de Carmen Ivorra, directora cient&iacute;fica de l&#39;empresa. Durant el desenvolupament de la tesi, Cristina Rusu gaud&iacute; d&#39;un contracte del programa de Doctorat Industrial de l&#39;Ag&egrave;ncia Estatal d&#39;Investigaci&oacute; (AEI). Aix&iacute; mateix, va realitzar una estada d&#39;investigaci&oacute; en el laboratori de Johanna Gostner en el Institute of Medical Biochemistry, Medical University of Innsbruck. El tribunal qualificador va estar format per Maria Vinaixa (Universitat Rovira i Virgili), Martie Verschuren (Avans University of Applied Sciences) i M&aacute;ria Džunkov&aacute; (I2SysBio), que va qualificar la tesi com a excel&middot;lent

Communications

Cristina Rusu defends her thesis on new primer design strategies for PCR

Cristina Rusu defends her thesis on new primer design strategies for PCR

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